Ti6Al4V合金因具有優(yōu)異的力學(xué)和生物學(xué)特征而在骨植入物和骨組織修復(fù)領(lǐng)域備受關(guān)注 [1] 。但是，Ti6Al4V合金材料導(dǎo)熱系數(shù)小，彈性模量低，這使得傳統(tǒng)制造技術(shù)難以滿足復(fù)雜Ti6Al4V合金精密零件的制作要求 [2] 。隨著先進(jìn)成型技術(shù)的快速發(fā)展，增材制造技術(shù)為上述問題提供了理想的解決途徑。激光粉末床融合技術(shù)（Laser Powder Bed Fusion, LPBF）具有加工分辨率高、設(shè)計(jì)靈活、成形穩(wěn)定、結(jié)果可預(yù)測(cè)等特點(diǎn)，是目前制造金屬部件最普遍采用的增材制造技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜多孔金屬材料的制備，可為患者提供“量體裁衣”式的骨科治療方案 [3] 。

鈦合金骨植入物的生物惰性是限制其臨床應(yīng)用的主要因素 [4] ，因此應(yīng)對(duì)其表面進(jìn)行改性處理，以提高其生物活性，促進(jìn)植入物與天然骨組織形成充分的骨整合 [5] 。鈦表面形貌可以通過多種改性方法改善 [5-10] ，目前廣泛采用的方法大致分為：物理處理法、化學(xué)處理法和生物處理法。其中，化學(xué)處理法操作簡(jiǎn)單，易在材料表面形成均勻涂層，結(jié)構(gòu)和成分與自然骨相似，并且對(duì)于多孔結(jié)構(gòu)而言，化學(xué)處理可使涂層均勻覆蓋在復(fù)雜孔洞表面，是一種最適用的表面處理方法 [11] 。化學(xué)處理方法又包括酸蝕處理、堿熱處理、陽(yáng)極氧化、微弧氧化等，是目前的研究熱點(diǎn)。本研究選用了經(jīng)濟(jì)有效的堿熱處理方法，經(jīng)堿熱處理后多孔鈦表面生成了一層具有生物活性的物質(zhì)，再誘導(dǎo)類骨羥基磷灰石沉積，提高了惰性生物材料的生物活性，并且不損害材料本身的良好性能 [4,12-14] 。但是，以往的研究表明，在堿熱處理過程中，材料表面的鈦酸鈉納米線易聚集為片狀，分布不均且易產(chǎn)生裂紋，降低了表面改性產(chǎn)生的生物活化效率，這對(duì)后續(xù)羥基磷灰石沉積、細(xì)胞的粘附和增殖都將產(chǎn)生不良影響 [15] ，甚至?xí)�影響材料的整體力學(xué)性能。因此，探究合適的堿熱處理參數(shù)是提高經(jīng)表面處理后材料生物活化效率的關(guān)鍵。

本研究通過優(yōu)化堿熱處理的工藝參數(shù)，在Ti6Al4V多孔鈦合金表面成功制備了分布均勻、大小適中且無(wú)裂紋的網(wǎng)狀納米結(jié)構(gòu)涂層，并對(duì)此活化層的成分進(jìn)行了分析；將表面改性后的樣品經(jīng)模擬體液浸泡，使其表面形成多層次的納米結(jié)構(gòu)涂層，并對(duì)樣品進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)成骨細(xì)胞粘附、增殖和分化過程的影響。

1 、實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品設(shè)計(jì)與制備

多孔鈦合金的單元結(jié)構(gòu)特征和孔隙率參數(shù)是調(diào)節(jié)其力學(xué)和生物學(xué)性能的關(guān)鍵因素 [16] 。

因六方金剛石結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等性能特點(diǎn) [17] ，在3-matic（Materialise）軟件中，以六方金剛石結(jié)構(gòu)為基本重復(fù)單元，設(shè)計(jì)了小梁直徑為0.37 mm，孔隙率為70%的TiS圓柱（Φ 6 mm × 10 mm），模擬松質(zhì)骨的孔隙度及幾何形狀特征。以Ti6Al4V合金粉末（粒徑15~53 μm）為原料，利用LPBF技術(shù)制備上述設(shè)計(jì)尺寸的Ti6Al4V多孔鈦合金試樣。打印參數(shù)：激光功率150 W，掃描速度1250 mm/s，鋪粉厚度0.03 mm，掃描間距0.05 mm。經(jīng)準(zhǔn)靜態(tài)壓縮實(shí)驗(yàn)測(cè)試得知，所制備的多孔鈦合金樣品的彈性模量為2.815 GPa，抗壓強(qiáng)度為95.008 MPa，可滿足人骨對(duì)骨替換材料的力學(xué)要求。

1.2 表面處理與細(xì)胞活性測(cè)試

分別配制3 mol/L和7 mol/L的NaOH溶液，備用。燒杯中加入適量37% HCl溶液，將試樣完全浸潤(rùn)其中，在水浴條件下50 ℃保溫60 min后取出，用大量去離子水和乙醇溶液超聲清洗、烘干。將試樣分別放入離心管中，加入適量3 mol/L或7 mol/L的NaOH溶液，水浴條件下60 ℃保溫1、4和10 h，具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)見表1。試樣取出后，用大量去離子水和乙醇溶液超聲清洗、烘干。最后，將試樣放入臥式爐中，通氬氣保護(hù)，在600 ℃下保溫30min，隨爐降溫后取出。采用掃描電子顯微鏡（SEM）和能量色散X射線光譜（EDS）表征樣品。另外，為了表征涂層，采用線切割將試樣軸向切開，使用SEM和EDS分析切面涂層。

選用最佳堿熱處理參數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行表面改性處理后，將樣品在37 ℃恒溫條件下置于模擬體液（SBF）中浸泡10 d（每48 h更換1次SBF），SBF成分如表1所示。取出浸泡后的試樣，放入烘干箱內(nèi)70 ℃烘干24 h以上。為方便區(qū)分，對(duì)不同方式處理的試樣分別命名：將六方金剛石結(jié)構(gòu)多孔鈦合金材料命名為TiS，將經(jīng)過堿熱處理的六方金剛石結(jié)構(gòu)多孔鈦合金材料命名為TiS-A，將經(jīng)過堿熱處理并在模擬體液中浸泡10 d的六方金剛石結(jié)構(gòu)多孔鈦合金材料命名為TiS-A SBF采用TiS、TiS-A和TiS-A SBF 這3組樣品，每組準(zhǔn)備3件試樣進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。由于所設(shè)計(jì)的植入物主要針對(duì)骨創(chuàng)傷或疾病引起的骨缺損，因此選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSC）采用直接接觸的方式培養(yǎng)到樣品上。

按照iCell原代間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)體系（PriMed-iCell-012-SF）配制，hBMSC細(xì)胞在5% CO₂ 、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為Control組和待測(cè)樣品組，其中，Control組每孔加入1000 μL 細(xì)胞懸液；待測(cè)樣品組先加入經(jīng)過121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌處理20 min后的樣品，再在每孔加入1000 μL細(xì)胞懸液。每個(gè)處理組均做3個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hBMSC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，采用直接接觸的方式，將hBMSC在48孔板鈦合金材料上接種2 × 10 4 個(gè)細(xì)胞，在5% CO₂、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗各孔3次，每孔加入1000 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基，再放入5% CO₂、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。最后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

細(xì)胞經(jīng)48 h培養(yǎng)后，采用活細(xì)胞/死細(xì)胞染色試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行染色，評(píng)估細(xì)胞存活力：熒光染料鈣黃綠素（Calcein-AM）染色活細(xì)胞呈綠色，熒光染料PI（碘化丙啶）染色死細(xì)胞呈紅色。采用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察染色樣品。

2、 結(jié)果與討論

2.1 鈦合金表面處理后的微觀組織表征

酸蝕預(yù)處理能夠去除鈦合金表面的污染物和氧化層。堿熱處理過程中，通過HTiO₃^- 和HTiO ₃ ‒ •nH ₂ O吸引Na ⁺ 在表面生成網(wǎng)狀的鈦酸鈉凝膠層，再經(jīng)高溫?zé)�結(jié)，表面脫水形成鈦酸鈉。采用不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)鈦合金表面進(jìn)行處理后，以電鏡觀察其微觀組織。如圖1所示，采用不同參數(shù)對(duì)鈦合金表面改性后，試樣表面均形成了納米線結(jié)構(gòu)，并且未產(chǎn)生裂紋。當(dāng)采用3 mol/L NaOH溶液時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)鈦合金表面呈現(xiàn)納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，納米線直徑變粗并呈現(xiàn)團(tuán)簇狀；NaOH濃度增至7 mol/L有利于鈦酸鈉納米線迅速生長(zhǎng)及密度增大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，鈦合金表面聚集為納米片狀結(jié)構(gòu)，中心容易形成大的孔洞，分布不均勻。

對(duì)鈦合金表面形貌進(jìn)行能譜分析，以 7 mol/L NaOH 溶液 60 ℃保溫 1 h 的處理方式為例，如圖 2 所示，試樣表面主要元素為 Na、O、Ti、Al、V。切割樣品對(duì)涂層進(jìn)行電鏡觀察（圖 3），可見 Al和 V元素分布在整個(gè)涂層中并呈現(xiàn)出微小的波動(dòng)，在邊界處 O元素出現(xiàn)明顯聚集。

綜上可知，采用高濃度堿溶液經(jīng)短時(shí)間保溫處理的鈦合金試樣具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有序、大小適中且分布均勻的表面形貌，可以為羥基磷灰石沉淀提供成核位點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞代謝過程的營(yíng)養(yǎng)和氧氣交換，并為骨長(zhǎng)入和骨整合提供適當(dāng)?shù)目臻g [18] 。本研究表明多孔鈦合金經(jīng)過酸洗預(yù)處理，用 7 mol/L NaOH溶液在 60 ℃下保溫 1 h 后，再經(jīng) 600 ℃燒結(jié) 30 min 為最佳表面改性工藝，模擬體液浸泡實(shí)驗(yàn)在此工藝下進(jìn)行。

經(jīng)過最佳表面改性工藝處理后，試樣經(jīng)SBF培養(yǎng)10d，表面出現(xiàn)羥基磷灰石沉積涂層及白色花狀沉淀，如圖 4所示。

在模擬體液浸泡過程中，堿處理后鈦合金表面的 Na + 與 H ₃ O ⁺ 進(jìn)行離子交換，使得鈦合金表面 pH 值增加，提高了 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 活性，從而促進(jìn)了磷灰石的形核；鈦合金表面形成了 Ti‒OH 官能團(tuán)，能夠吸引模擬體液中的 Ca ²⁺ ，提高鈦和鈦合金表面的 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 的過飽和度。堿處理后，鈦合金表面呈多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，TiO₂的密度增加，為磷灰石提供了優(yōu)越的異質(zhì)形核位置，促使磷灰石從模擬體液中快速沉積出來而形成羥基磷灰石涂層。

2.2 多孔Ti6Al4V合金材料的生物學(xué)性能

為了評(píng)價(jià)多孔 Ti6Al4V 合金材料的生物相容性，從細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞相對(duì)活性兩個(gè)方面進(jìn)行了考察。

采用直接接觸的方式將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在 TiS 上培養(yǎng) 48 h后的 CLSM結(jié)果如圖 5所示，Calcein-AM 可將活細(xì)胞染色而呈綠色、PI 可將死細(xì)胞染色而呈紅色（PI 染劑會(huì)被基體材料吸附）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng) 48 h 培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞均存活良好，僅有少量細(xì)胞死亡。相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均勻分布在基體上，密度較高，但 Ti6Al4V合金材料的孔隙中不存在細(xì)胞，顯示出良好的貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中，鈦酸鈉納米線網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可促進(jìn)初始細(xì)胞粘附和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，有利于早期骨再生。堿處理后的多孔 Ti6Al4V 合金經(jīng)過模擬體液浸泡后，表面形成的磷灰石層是一種典型的生物活性材料，可與周圍骨組織發(fā)生化學(xué)鍵合，進(jìn)一步提高其生物活性。

CCK8測(cè)試法是一種可用于細(xì)胞增殖和毒性分析等方面的生物測(cè)試方法。本研究采用CCK-8測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞增殖。根據(jù)式（1）計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)試樣的細(xì)胞相對(duì)活性(Cell Vitality)。

式（1）中：OD e 為實(shí)驗(yàn)組 OD 值，OD b 為背景 OD 值，OD c 為對(duì)照組 OD 值，OD = lg（1/trans）。其中，OD b 為多孔板本身（未加培養(yǎng)基和細(xì)胞的孔）的吸光度。

由圖 6 可見，TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的細(xì)胞相對(duì)活力分別為 50.91%、52.47%、58.53%，Ti6Al4V 合金具有優(yōu)良的生物相容性，表面改性處理生成了鈦酸鈉納米線層，有助于提高材料生物活性；表面再經(jīng)模擬體液浸泡，生物活性進(jìn)一步提高，細(xì)胞相對(duì)活性由未處理前的 50.91%提高至 58.53%。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中，鈦酸鈉納米線網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可促進(jìn)初始細(xì)胞粘附和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，有利于早期骨再生。堿處理后的多孔 Ti6Al4V 合金經(jīng)過模擬體液浸泡后，表面形成的磷灰石層是一種典型的生物活性材料，可與周圍骨組織發(fā)生化學(xué)鍵合，進(jìn)一步提高其生物活性。

3、 結(jié)論

對(duì)多孔 Ti6Al4V 合金的最佳堿熱處理工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的生物學(xué)性能，得到如下結(jié)論：

1）堿熱處理過程采用較低濃度堿溶液時(shí)，鈦合金表面在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，納米線直徑變粗呈現(xiàn)團(tuán)簇狀；采用較高濃度堿溶液時(shí)，有利于鈦酸鈉納米線迅速生長(zhǎng)及密度增大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，鈦酸鈉納米線聚集為納米片狀結(jié)構(gòu)，中心容易形成大的孔洞，分布不均勻。

2）多孔 Ti6Al4V 合金本身具較好的生物學(xué)性能，經(jīng)堿熱處理后，表面形成鈦酸鈉納米線涂層，細(xì)胞相對(duì)活性由 50.91%提高至 52.47%；再將堿熱處理后的 Ti6Al4V 合金材料浸入 SBF 溶液中浸泡 10 d，表面會(huì)生成磷灰石涂層，此時(shí)的細(xì)胞相對(duì)活性提高至 58.53%。

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